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本试剂盒采用镍柱纯化系统，对6×His-tag蛋白具有显著特异吸附能力，能够高效一步纯化带有6个组氨酸亲和标签的蛋白。该系统具有4个Ni2+螯合位点，较只有3个螯合位点的Ni-IDA结合Ni2+更为牢固，有效防止纯化过程中Ni2+脱落且增强对His标签蛋白的结合能力，提高纯化效率。较高的基团密度，大大提高了蛋白载量。该系统在天然或变性条件下，对来源于各种表达系统（如杆状病毒，哺乳细胞，酵母以及细菌）中的His标签蛋白，均有很好的纯化效果。本制品已螯合镍离子，可直接用于包涵体蛋白的纯化，使用方便，快捷。

• 在纯化之前采用电泳检测蛋白的可溶性，本试剂盒只适合于包涵体蛋白的纯化，如需纯化可溶性蛋白，请选择我公司的His标签蛋白纯化试剂盒(可溶性蛋白)(货号：WE0267)。
  
• 缓冲液中不建议使用β-巯基乙醇、DTT和EDTA。
  
• 整个纯化过程中切忌凝胶脱水变干。
  
• 为提高纯化效率，首先确定Binding Buffer和Elution Buffer中Imidazole（咪唑）的最佳使用浓度。必要时可以使用线性或梯度浓度的Imidazole（咪唑）（10～500mM）洗脱蛋白，并通过SDS-PAGE或Western Blotting来检测目的蛋白的纯度。
  
• 请使用高纯度的试剂配制缓冲液，并通过0.22μm或者0.45μm过滤器过滤。为避免柱子被堵塞，建议将裂解液进行离心，或者使用0.22μm或者0.45μm过滤器过滤。
  
• 柱再生时，保证每步洗完后都要用足够的去离子水冲洗至中性。
  
• 如果有些蛋白采用尿素的溶解效果不好，可以采用盐酸胍进行溶解。

• 缓冲液的准备
  包涵体蛋白纯化缓冲液配方：
  

  成分	Tris-HCl(pH7.9)	Imidazole	NaCl	Urea
  Binding Buffer	20mM	5mM	0.5M	8M
  Elution Buffer	20mM	500mM	0.5M	8M

• 组装层析柱
  • 将Ni-Agarose Resin填料混匀后加入层析柱，室温静置10分钟，待凝胶与溶液分层后，把底部的出液口打开，让乙醇通过重力作用缓慢流出。。
    注意：
    
    • 填料的上层是乙醇保护层，将填料和乙醇一起混匀，以每ml填料纯化20～30mg His标签蛋白计算，取需要的填料与乙醇的混合液加入层析柱。
      
    • 如果乙醇不流出，可以给柱子一个外力，例如用大拇指对柱口轻轻按压一下，迫使乙醇流出。
      
    • 本实验都是通过重力作用使溶液流出。
  • 向装填好的柱中加入5倍柱体积的去离子水将乙醇冲洗干净后，再用8倍柱体积的Binding Buffer平衡柱子，平衡结束后即可上样。
    注意：柱体积指的是填料的体积。
• 包涵体蛋白的纯化
  
  • 收集菌体后，每100mg菌体(湿重)加入2mL细菌裂解液(每1mL细菌裂解液中请预先加入10μL蛋白酶抑制剂混合物)，如有需要可以超声裂解菌体。
    注意：
    
    • 当提取物粘度高或提取蛋白为包涵体时，建议加入DNase I和Lysozyme。每1mL细菌抽提试剂中加入1μL DNase I(1000U/mL)，2μL Lysozyme(50mg/mL)，DNase I和Lysozyme可单独从我公司购买，溶菌酶(货号：WE0214)、RNase-Free DNase I(货号：WE0213)，如使用其它公司产品，请按照相应说明书操作。
      
    • 超声过程中保持菌液处于冰浴中，超声条件依赖于所使用的超声仪功率，探头种类，容器的大小形状，需实验中自己摸索，应避免连续超声导致的大量产热，可分成短时间，多次超声，通过一定的间隔时间避免溶液过热。最终菌液变清即可。
  • 10000×g，4℃离心15分钟，分离上清和沉淀，并收集沉淀。
    
  • 将沉淀重悬于Binding Buffer中，尽量混匀使包涵体充分溶解。
    
  • 10000×g离心20分钟，收集上清。
    注意：建议将离心后的上清以孔径为0.22μM或者0.45μM的滤膜过滤。
    
  • 将上清负载上柱，流速为10倍柱体积/小时，收集流穿液。
    注意：
    
    • 本试剂盒中附带有一块筛板，使用时先将筛板加至填料的上层，再将处理好的上清负载上柱。该筛板可用于杂质较多的蛋白的过滤，防止过多的杂蛋白堵塞柱子，但是筛板放入柱子后不易取出。
      
    • 通过控制加入的上清(菌体裂解液)的速度来控制流速。
  • 使用15倍柱体积的Binding Buffer冲洗柱子，洗去杂蛋白。
    
  • 使用适量Elution Buffer洗脱，收集洗脱峰。
    注意：通过蛋白监测仪监测，洗脱峰可以分管收集，每1mL收集1管。
    
  • 洗脱后，依次使用5倍柱体积的Binding Buffer，5倍柱体积的去离子水洗涤柱子，再用3倍柱体积的20%乙醇平衡(乙醇要将填料浸没)，封柱后2～8℃保存。
    注意：
    
    • 在纯化包涵体蛋白时，所有缓冲液均含有变性剂，可以降低Binding Buffer中的咪唑浓度(比5mM更低)。洗脱时，若蛋白在较高pH下洗脱失败，可以选用低pH缓冲液作为洗脱缓冲液(pH6.5，pH5.9或pH4.5)。
      
    • 如果是分段梯度洗脱，最大洗脱缓冲液中咪唑浓度未达到500mM，则使用浓度为500mM的咪唑进行洗脱10倍柱体积后，再进行第8步的操作。
• 柱再生
  当填料使用多次后，结合效率会有所下降(表现为流速变慢或填料失去蓝绿色)，可以用以下方法再生，提高填料的使用寿命和蛋白质的结合效率。
  
  • 使用2倍柱体积的6M盐酸胍冲洗后，使用3倍柱体积的去离子水冲洗。
    
  • 使用1倍柱体积的2% SDS冲洗。
    
  • 依次使用1倍柱体积的25%、50%、75%和5倍柱体积的100%乙醇冲洗，再依次使用1倍柱体积的75%、50%和25%的乙醇冲洗。
    
  • 使用1倍柱体积的去离子水冲洗。
    
  • 使用5倍柱体积含50mM EDTA缓冲液(PH8.0)冲洗。
    
  • 使用3倍柱体积去离子水，3倍柱体积20%乙醇冲洗。
    
  • 2～8℃保存。
    
  • 再次使用前，需首先使用10倍柱体积去离子水冲洗，然后使用5个柱体积的50mM NiSO4再生，3个柱体积的Binding Buffer平衡。